【脑科学科普】专栏
第035期
# 脑海Yeah 第 43 期 #
文 | 周诚尔
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案件背景——关于结节性硬化
结节性硬化（Tuberous Sclerosis Complex, TSC）是一种常染色体显性遗传、多系统累及（图1）的疾病[1]，临床表现主要有惊厥发作、自闭症谱系障碍、智力障碍等。其主要致病基因是位于9号染色体上的TSC1基因或位于16号染色体上的TSC2基因[2]。
图 1 结节性硬化的临床表现
本次推理任务：
寻找导致结节性硬化脑部病理改变的“真凶“
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梳理“时间线”，发现矛盾点
既往基于小鼠模型的研究中，结节性硬化的发病是TSC1或TSC2的一个等位基因已经失活（TSC+/-）的基础上，发生第二个等位基因的失活(TSC-/-)，即“二次打击”学说（图2）。依照该逻辑，第二个等位基因失活在前，结节性硬化的特征性病变在后。
图 2 既往的“二次打击”学说
然而，患者的基因分析显示，大多数的肿瘤样本中可发现第二个等位基因的缺失突变，而在皮质结节样本中，这样的纯合缺失突变并不多——这挑战了以往的“二次打击”模型。
机智的研究人员就此假设，小鼠模型与患者病理的不一致或许是由于人脑特有的细胞类型在疾病的发生发展过程中起到了关键性的作用。
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探案新工具——构建结节性硬化大脑类器官模型
图 3 结节性硬化大脑类器官模型构建
研究团队将结节性硬化患者外周血单核细胞/PBMCs重编程为诱导多能干细胞/iPSCs，再于不同营养环境中生成类器官（图3）。其中一名患者由于是嵌合体，可构建TSC2+/-和TSC2+/+(对照组)两种类器官，而另一名TSC2+/-患者除了构建TSC2+/-类器官外，也通过CRISPER-Cas9修复构建TSC2+/+(对照组)类器官。
经过相应的染色验证，TSC+/-类器官可以概括结节性硬化患者脑部的主要组织病理变化（图4）。如图3B所示，低营养环境中类器官倾向于形成结节样结构，高营养环境中类器官倾向于形成肿瘤样结构。
图 4 患者来源的TSC2+/-类器官与对照组类器官之间肿瘤和结节病变情况对比
研究团队接着对在高营养培养基中培养220天的类器官进行染色，发现培养到这个时间段，类器官中基本都是肿瘤组织。接着，他们利用UMAP（一种非线性降维的算法）揭示了在TSC2+/-患者来源的高营养类器官中主要是中间神经元、中间神经元祖细胞、分裂中的中间神经元祖细胞3个群组，兴奋性神经元只占很小一部分（图5A）。并且图5A中3个主要群组的细胞在9个肿瘤区域中分布均匀（图5B），这说明这样的细胞构成分布情况在肿瘤中相对普适，较为可靠。
图 5
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聚焦疑点
问
两个等位基因均失活是否是肿瘤发生的必要条件？
答
并不是。
图 6 杂合突变、纯合突变的肿瘤均存在
杂合突变的肿瘤中未发现基因重组，失去杂合性（Loss of Heterozygosity, LOH）的肿瘤是以拷贝数不变（copy-neutral，cn）的形式实现的。
那么既然TSC类器官中肿瘤形成不是必须通过cnLOH，研究人员假设或许是TSC1/2蛋白表达量少，导致中间神经元祖细胞进一步减少TSC1/TSC2蛋白表达量。荧光免疫染色显示，在EGFR+的中间神经元祖细胞中，无论是对照组类器官，还是TSC2+/-类器官，其TSC2表达量均有减少。虽然在对照组类器官中，TSC1和TSC2的表达量在EGFR+细胞中都有下降，在TSC肿瘤细胞中，TSC2一个等位基因的突变导致了尤其明显的TSC2表达量减少（图7）。
图 7 TSC表达量
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锁定“元凶”
220天的TSC肿瘤类器官中，尾侧神经节隆起/CGE相关（图8A）的细胞占比最高（图8B），且在110天类器官中，高营养和低营养环境的TSC+/-类器官与对照组相比，CGE相关的细胞均更多。
图 8
此外，根据单细胞轨迹分析的结果，肿瘤和结节类器官有着CGE祖细胞到CGE中间神经元的共同轨迹（图9），而这与在人类胚胎大脑中的观察结果一致。
图 9
至此，相关证据表明，扩增的CGE祖细胞在妊娠中期的较晚阶段出现，此时恰好是皮质结节和室管膜下肿瘤在TSC患者中开始出现的时刻。基于CGE来源和较晚出现两大特征，研究人员将这些细胞命名为尾端迟现中间神经元祖细胞/caudal late interneuron progenitor cells/CLIP cells。
一系列染色结果表明， TSC肿瘤类器官中的神经祖细胞主要是CLIP细胞（图10）。这也可以解释，室管膜下结节/室管膜下巨细胞性星形细胞瘤的分布位置为何总在尾侧丘脑沟/caudothalamic groove。相似地，在TSC结节类器官中，巨型细胞表达CLIP细胞标记物、CGE标记物说明了其CLIP细胞的来源（图11）。
图 10 染色结果之一：EDNRB在肿瘤类器官及成人患者SEGA样本中均有表达
图 11 染色结果之一：EDNRB在类器官的GCs及胎儿结节病灶中均有表达
总结
让我们先把这位导致结节性硬化肿瘤和结节病变的“元凶”——CLIP细胞关进笼子。
CLIP是否是真凶呢？基于现有的证据，我们有理由认为是。它利用既往不够敏锐的探案工具——动物模型，将自己藏匿于“拷贝数不变的杂合性丧失/cnLOH“这种现象的背后。而现在我们知道了，cnLOH虽然出现在肿瘤发展过程中，但并不是其真正的起因。
本次案件的侦破也提示我们，要捉拿“真凶”，良好的探案工具很关键，即利用人类模型如类器官去揭示疾病机制的必要性。
参考文献
[1] HENSKE, E.P., S. JOZWIAK, J.C. KINGSWOOD, et al., Tuberous sclerosis complex[J]. Nat Rev Dis Primers, 2016. 2: 16035.
[2] CATLETT, T.S., M.M. ONESTO, A.J. MCCANN, et al., RHOA signaling defects result in impaired axon guidance in iPSC-derived neurons from patients with tuberous sclerosis complex[J]. Nat Commun, 2021. 12(1): 2589.
[3] EICHMULLER, O.L., N.S. CORSINI, A. VERTESY, et al., Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects[J]. Science, 2022. 375(6579): eabf5546.（本文原文）
脑科学转化研究院
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